Jak vědci oddělují, co pouhým okem nespatříš
Abychom mohli studovat, jak buňky pracují, čím se liší, jaká je jejich funkce, nebo proč v buňce probíhají určité procesy, musíme buňky rozbít a studovat jejich stavební kameny – bílkoviny a nukleové kyseliny. Ty musíme z buňky “vytáhnout“, neboli vyizolovat / vyextrahovat.
Extrakce nukleových kyselin a proteinů z biologických vzorků je proces, který spočívá v oddělení těchto molekul od ostatních částí buněk. Obvykle se provádí v několika krocích, zahrnujících rozbití (lýzu) buněk, odstranění nepotřebných částí a nečistot a konečně izolaci a přečištění cílových molekul. Lýza se provádí mechanicky nebo chemicky. Nukleové kyseliny se po přečištění vysráží z vodného roztoku přidáním alkoholu. Oproti tomu se proteiny nejčastěji izolují na základě jejich fyzikálních a chemických vlastností např. elektroforézou, chromatografií nebo srážením pomocí protilátek. Těmito postupy z buňky získáváme směs různých látek.
Směsi nukleových kyselin a proteinů je ale potřeba dále analyzovat. Proto je nutné je dále rozdělit – nejčastěji podle velikosti v porézním gelu pomocí elektrického proudu, tzv. gelovou elektroforézou. Nejkratší molekuly putují nejrychleji, nejdelší se naopak cestou zasekávají a průchod jim trvá déle. Vznikají tak charakteristické „proužky“. Jeden proužek ale stále představuje směs více molekul, které můžeme dále rozdělit.
Elektroforéza může být jednoduchá – používá se například už pro zacílené úseky genů, u kterých nás zajímá jejich přesná délka (a tím i pozice proužku v gelu). Také ji ale můžeme spojit s dalšími postupy, kdy DNA z celého přírodního vzorku, např. půdy, během cesty gelem ještě srážíme – vzniká tak charakteristický vzor, „otisk prstu“ – taková metoda se nazývá DGGE (denaturační gradientová gelová elektroforéza).
Proužky v gelech ale nejsou vidět a je nutné je obarvit. Pro DNA se nejčastěji používají barviva, který se vmezeří do struktury dvoušroubovice a po ozáření UV nebo modrým světlem následně fluoreskují. Mezi taková barviva patří např.ethidium bromid, barviva SYBR nebo jejich alternativy. Lze také použít barvení stříbrem. Pro proteiny se pak často používají barviva viditelná okem, bez nutnosti fluorescence, např. modř Coomassie. Obarvené proužky pak můžeme spočítat, zjistit jejich velikost, odhadnout množství DNA/proteinu v nich, atd.
Blotování
Barvením se označují všechny DNA nebo všechny proteiny v jednom proužku. Pokud nás ale zajímá jen jedna konkrétní molekula nebo její část, je nutné použít jiné metody práce a tu část si označit. Nejznámější metodou je tzv. blotování, během kterého dochází k přenosu bílkovin a nukleových kyselin z gelu na speciální membránu. Tu lze dále použít např. k navázání specifické sondy nebo protilátky. Přenos DNA se označuje Southern blot (podle autora metody), přenos RNA je Northern blot a bílkovin pak Western blot (tyto názvy byly uměle doplněny podle světových stran – používá se spojení blotovací kompas).
Po Western blotu (tj. přenosu proteinu na membránu) je opět potřeba neviditelný proužek odhalit, obarvit. Nejprve použijeme barviva, která se vážou na všechny proteiny (stříbro, modř Coomassie, Ponceau atd.) – tím si potvrdíme, že přenos byl úspěšný. Potom můžeme cílit přesně na určitý protein například pomocí fluorescenčně značených protilátek (imunofluorescence). Fluorescenční značení lze nahradit i jiným typem barvení, například protilátkami s křenovou peroxidázou, která po dodání dalších látek, tzv. substrátu, vytváří tmavou skvrnu (tzv. kolorimetrie) nebo světlo (tzv. chemiluminiscence).
Velmi podobný postup se používá i pro DNA a RNA. U nukleových kyselin se kromě fluorescence dá využívat také značení radioizotopy. K tomu se používá sonda, nesoucí radionuklid (nejčastěji fosfor 32P), která přesně zapadá (je komplementární) s cílovým genem na úrovni jednotlivých „písmenek“ genetického kódu.
