Co nám barvy prozradí o buňkách
Barvení buněk slouží k jejich označování, vyhledávání, sledování, určování nebo funkční analýze. Metody zahrnují přímé značení (zavedení značky nebo barviva přímo do buňky) a nepřímé značení (pomocí reportérového genu) (viz předchozí článek o typech značení). Značení buněk může být prováděno tzv. in vivo (v organismu) nebo ex vivo (mimo organismus).
V buňkách se dá označit
- určitá buněčná struktura – např. jádro, membrána, mitochondrie, cytoskelet atd.,
- metabolický proces – často s pomocí radioizotopů
- jednotlivé proteiny (pomocí protilátek nebo značkovacích proteinů)
- nukleové kyseliny (například metodou fluorescenčních sond)
Z různých typů značení jsme se v tomto článku chtěli zaměřit na barvení buněk pro jejich studium pod mikroskopem. V mikroskopii se barvení používá ke zvýšení kontrastu a viditelnosti. Mnoho biologických vzorků je téměř průhledných, takže je obtížné vidět jejich struktury. Různá barviva se dokážou vázat na různé buněčné části, a proto lze po obarvení tyto struktury nejen vidět, ale i rozlišit mezi sebou.
Studium buněk je důležité hlavně v mikrobiologii, histologii (mikroskopické studium biologických tkání), v cytologii (mikroskopické studium buněk) a v lékařských oborech histopatologie, hematologie a cytopatologie, které se zaměřují na studium a diagnostiku nemocí na mikroskopické úrovni. Aby bylo možné výsledky analýz porovnávat na celosvětové úrovni, byla Komisí pro biologické barvení (BSC) zavedena standardní barviva, u kterých se pečlivě sleduje složení i mezi různými výrobci.
K barvení se používá řada postupů – barvení jednotlivými barvami, jejich směsí, pomocí fluorescenčních protilátek atd. Mezi nejznámější metody patří Gramovo barvení bakterií, Hematoxylin a eosin (H&E) v histologii, barvení stříbrem (pro zobrazení DNA a proteinů) nebo pomocí fluorescenčních protilátek. Většina barviv se používá na neživé (tzv. fixované) buňky, na živé buňky lze použít pouze určité typy barviv. Některé vybrané techniky Vám přiblížíme v následujících řádcích.
Jednoduchá barviva
DAPI
DAPI je fluorescenční barvivo aktivované UV světlem, které po navázání na DNA silně modře fluoreskuje. Používá se proto pro barvení buněčných jader při fluorescenční mikroskopii a využívá se hlavně při počítání buněk.
Ethidium bromid
Ethidium bromid (EB) se vmezeřuje do řetězce DNA a po osvícení UV světlem vyzařuje oranžovočervené světlo. Ethidium bromid se také často používá pro značení buněčné smrti nebo při sledování životaschopnosti buněk. EB se také používá pro obarvení proužků nukleových kyselin v gelové elektroforéze.
Hoechst
Hoechst se podobně jako DAPI váže na DNA. Barviva Hoechst se často používají ve fluorescenční mikroskopii pro barvení DNA – při UV excitaci vyzařují modré nebo zelené světlo. Nejběžněji se používá barvivo Hoechst 33342, které snadněji prochází buněčnou membránou.
Methylenová modř
Methylenová modř se používá k barvení živočišných buněk, jako jsou lidské buňky z vnitřku ústní dutiny. Buněčná jádra jsou po obarvení methylenovou modří jasně viditelná. Používá se také k barvení krevních nátěrů v cytologii.
Safranin
Safranin je červené barvivo, které se váže např. na DNA v jádrech buněk, nebo také na lignin v rostlinných tkáních.
Stříbro
Barvení stříbrem se používá pro zachycení proteinů a DNA. Tato metoda se po svém objeviteli jmenuje Golgiho metoda – používá se například pro barvení neuronů.
Barviva DNA na bázi thiazolové oranži
Mezi tato barviva patří např. SYBR barviva nebo Pico Green. Jsou to barviva běžně používaná pro zviditelnění DNA pomocí fluorescence, hlavně při gelové elektroforéze.
Barvení více barvami
Gramovo barvení
Gramovo barvení se používá k zařazování bakterií na základě složení jejich buněčné stěny a membrány. Gramovo barvení používá krystalovou violeť, jód (Lugolův roztok), alkohol a safranin. Gram-pozitivní bakteriezůstávají obarveny tmavě fialově. Gram-negativní bakterie se po odbarvení alkoholem obarví safraninem do růžova.
Hematoxylin a eosin (H&E)
Barvení hematoxylinem a eosinem se používá jako „zlatý standard“ v histologii k vyšetření tenkých řezů tkáně. Hematoxylin barví buněčná jádra modře, eosin barví cytoplazmu, pojivovou tkáň a mimobuněčný prostor růžově.
Imunofluorescence
Imunofluorescenční barvení využívá fluorescenčně značené protilátky k navázání a obarvení určitých proteinů nebo antigenů v buňkách nebo tkáních. Protilátky se vážou na (cílové molekuly) v buňce nebo tkáni. Zároveň protilátky nesou fluorescenční barviva (fluorofory), které vyzařují různě barevné světlo, když jsou vybuzeny světlem o jiné barvě (např. UV světlo vybudí fluorofor modré barvy, modré světlo fluorofor zelené barvy atd.).
Modrá (DAPI) jádra buněk, zelené a červené (imunofluorescence) neurony.
Elektronová mikroskopie
Zvláštní kapitolou jsou pak barviva používaná pro barvení vzorků pro elektronovou mikroskopii. Cílem je zvýšit kontrast, zejména pro transmisní elektronovou mikroskopii. Nejčastěji se využívají látky na bázi těžkých kovů, např. kyselina fosfowolframová (barví okolí buněk tmavě, vzorek zůstává světlý), oxid osmičelý (nejběžnější barvivo pro elektronovou mikroskopii biologických materiálů), nebo také koloidní zlato (navazuje se ve formě protilátek, které označují cílové místo, např. protein, v buňce a na obrázku se zobrazí jako tmavá tečka.
