Jak sledujeme buňky a molekuly v akci
Moderní výzkum v biologii, biochemii nebo medicíně se neobejde bez různých druhů vzorků – od orgánů, tkání a buněk, až po jejich stavební kameny – bílkoviny a nukleové kyseliny (DNA, RNA). Takové vzorky ale nejde snadno pozorovat pouhým okem. Je proto nutné je nějakým způsobem zviditelnit, podobně jako si v poznámkách nebo učebnici zvýrazňovačem označujete části, které vás nejvíce zajímají nebo je chcete rychle najít.
Celý komiks věnující se problematice značení, a řadu dalších naleznete na komiks.mgp.cz.
Různé postupy, souhrnně pojmenované jako značení, jsou základním nástrojem biologického výzkumu nebo diagnostiky, který umožňuje vědcům a lékařům studovat to, co běžně vidět není. Značit můžeme in vivo, tzn. přímo v živých organismech. Pak jsme schopni vidět například polohu buněk v orgánu. Značením můžeme sledovat i to, kde v buňkách probíhají určité biochemické reakce. Zkoumání buněk mimo tkáně, ve zkumavce, buněčné kultuře nebo na mikroskopovacím sklíčku, se nazývá in vitro. Mezi in vitro metody patří také barvení izolovaných nukleových kyselin a proteinů.
Značení je proces, kdy se určitá značka připojuje k molekulám nebo strukturám, abychom je mohli nalézt, zviditelnit a analyzovat. Těmito značkami mohou být chemické látky, fluorescenční barviva a geneticky kódované značky, nebo také radioaktivní nebo stabilní izotopy.
Značit je možné několika způsoby:
- Chemicky
Chemické značení znamená navázání různých barviv na struktury buňky nebo i použití cílených značek např. bílkovinám nebo jiným biomolekulám. Barviva se využívají zejména v mikroskopii pro zvýšení kontrastu a zviditelnění struktur uvnitř vzorku. Barvením buněk se zabývá celý samostatný článek.
Dalším příkladem chemického značení je použití biotinylace, při kterém se molekula biotinu naváže na protein nebo nukleovou kyselinu. Následuje krok s využitím další molekuly – streptavidinu. Streptavidin je protein, který se váže na biotin a vytváří komplex – shluk, který pomáhá najít a zvýšit signál hledané molekuly, nebo ji dokonce izolovat a přečistit.
- Fluorescenčně
Fluorescenční molekuly, tzv. fluorofory, se vážou na proteiny nebo nukleové kyseliny v buňkách a to umožňuje jejich sledování pomocí fluorescenčních mikroskopických technik. Tato metoda umožňuje zviditelnit a studovat různé buněčné procesy a struktury s vysokou citlivostí a specifičností. Mezi fluorescenční molekuly patří
- Fluorescenční barviva – malé molekuly, které se vážou přímo s proteiny nebo strukturami v buňce. Některá lze použít nejen pro zafixované preparáty, ale i v živých buňkách.
Fluorescenční protilátky – proteiny, které se cíleně vážou pouze na vybrané molekuly v buňce. Protilátky mohou být označeny přímo fluorofory nebo nepřímo s použitím další „vrstvy“ protilátek nesoucích fluorofor.
- Geneticky:
Mezi složitější techniky patří genetické značení. Hlavním krokem je připojení značkovacího proteinu k cílovému studovanému proteinu. Prakticky to lze udělat tak, že pomocí genového inženýrství prostě spojíme dva geny do jednoho a vytvoříme tak gen pro tzv. fúzní protein.
Nejznámějším značkovacím proteinem je zřejmě GFP – zelený fluorescenční protein, izolovaný z medúzy. Existují ale další, jinak barevné fluorescenční proteiny, např. červený (RFP) nebo žlutý (YFP).
Ne všechny značkovací proteiny jsou ale fluorescenční. Existují další typy značek, např. polyhistidine-tag (His-tag), využívající histidinových zbytků k přečišťování, vyhledávání a zviditelňování cílového proteinu.
- Izotopově:
Izotopové značení využívá stabilní nebo radioaktivní izotopy prvků ke sledování molekul. Metoda zahrnuje nahrazení atomů prvků v molekule za jejich izotopy (izotopy jsou atomy s jiným počtem neutronů v jádře). To umožňuje jejich sledování a odlišení od běžných atomů prvku. Izotopy mají velké možnosti využití od geologie přes biologii až po medicínu.
Izotopy lze rozdělit na:
- Stabilní izotopy jsou neradioaktivní a odlišují se pouze hmotností. Využívají se hlavně při zkoumání hornin, v archeologii, ekologii, kriminalistice nebo medicíně (např. pro sledování původu, výživy, onemocnění atd.). Nejčastěji se používají izotopy uhlíku, dusíku, kyslíku nebo stroncia.
- Radioaktivní izotopy, které se postupně přeměňují a uvolňují měřitelné záření, které umožňuje sledovat i nepatrná množství. To významně zvyšuje citlivost analýz. Radioizotopy můžeme využít pro sledování, v které buňce, tkáni nebo molekule se zachytí značená látka. Tím můžeme sledovat metabolismus buněk i celých tkání a orgánů jak ve vědě, tak např. v nukleární medicíně. Takto se nejčastěji se používají např. fosfor 32P a 33P pro značení nukleových kyselin a vodík 3H, uhlík 14C, síra 35S a jód 125I pro značení proteinů. V nukleární medicíně to pak je technecium 99mTc a fluor 18F pro diagnostiku a jód 131I a lutecium 177Lu pro terapii.
